Application Note PX022
Einführung
Vor kurzem haben wir ein 4-Kreis-Diffraktometer mit geschlossener Röhre für die Kristallographie kleiner Moleküle und Makromoleküle vorgestellt, das XtaLAB Synergy-S. Es verfügt über drei neue Technologien in einem kompakten Gehäuse, das in jedes Heimlabor passt: Mikrofokus-PhotonJet-S-Quellen (mit Cu-, Mo- oder Ag-Targets), ein ultraschnelles (10° pro Sekunde) Kappa-Goniometer und einen hybriden Photonenzählungsdetektor HyPix-6000HE mit 0,1 mm x 0,1 mm großen Pixeln. Hier haben wir einen zweistündigen Datensatz an einem Thaumatin-Kristall gesammelt, um die Qualität der Daten des XtaLAB Synergy-S-Systems anhand eines Proteinkristalls mit einer durchschnittlichen Einheitszellengröße zu demonstrieren.
Experimenteller Überblick
T. daniellii Thaumatin wurde von Sigma gekauft und in hochreinem Wasser von Laborqualität in einer Konzentration von 50 mg/ml suspendiert. Thaumatin-Kristalle wurden bei 18 °C aus hängenden Tropfen gezüchtet, die aus 6 μl 50 mg/ml Thaumatin plus 4 μl Kristallisationslösung [24 % (w/v) NaKTartrat, 15 % (v/v) Ethylenglykol und 0,1 M BisTris Propan, pH 6,6] über einer Vertiefung mit 500 μl Kristallisationslösung bestanden. Vor der Flash-Kühlung wurde jeder Kristall zum Kälteschutz für 15 bis 30 Sekunden in der oben genannten Kristallisationslösung mit 25 % (v/v) Ethylenglykol getränkt. Die Spezifikationen des XtaLAB Synergy-S-Systems und des Detektors sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: XtaLAB Synergy-S-Spezifikationen.
| Röntgenquelle | PhotonJet-S Cu-Quelle mit kontinuierlich variablem Divergenzspalt Strahlgröße = 100 µm |
| Betriebsleistung | 50 kV x 1 mA = 50 W |
| Goniometer / Detektorbereich | 4-Kreis Kappa mit ausfahrbarem 2θ-Arm / Entfernungsbereich von 30 - 250 mm |
| Detektor Aktive Fläche Auslesezeit Pixelgröße Kühlung |
Hybride Photonenzählung HyPix-6000HE 77,5 x 80,3 mm Kontinuierlich (7 ns) 100 µm luftgekühlt |
Die Datenerfassung wurde mit CrysAlisPro durchgeführt, die Verarbeitung erfolgte mit XDS¹, und die Strukturlösung wurde mit verschiedenen Programmen über HKL-3000R² durchgeführt. Ein großer (0,6 mm x 0,3 mm x 0,3 mm) Thaumatin-Kristall wurde für die Datenerfassung ausgewählt, um das Worst-Case-Szenario für die Spotausbreitung aufgrund von Strahldivergenz zu veranschaulichen (Abbildung 1).
Abbildung 1: Thaumatin-Kristall. Der Rasterabstand beträgt 0,1 mm. Der Kreis ist 0,3 mm groß.
Ergebnisse
Der Thaumatin-Kristall beugte sich bis über 2 Å hinaus, und die automatische Indizierung ergab eine primitive tetragonale Einheitszelle mit a = b = 57 Å und c = 149 Å. Der Punktabstand entlang der längsten Kante der primitiven Zelle wurde mit der vollen Divergenz des Röntgenstrahls und einem Detektorabstand von 60 mm erreicht (Abbildung 2).
Abbildung 2: 20-Sekunden-Belichtung pro 0,2°-Drehung des Thaumatin-Kristalls bei einem Abstand von 60 mm auf der HyPix-6000HE. Die Auflösungsringe betragen 7,09, 3,74 und 2,68 Å. Die vergrößerte Darstellung zeigt die Lunen entlang der 150 Å langen Zellkante. Die Peakseparation und der d-Abstand der blau umrahmten Spots sind in der Grafik rechts dargestellt.
Sechs Scans, die mit dem Strategiealgorithmus von CrysAlisPro berechnet wurden, wurden gesammelt, um in 2 Stunden vollständige, redundante Daten bis 1,4 Å zu erhalten (Tabelle 2).
Tabelle 2: Für Thaumatin gesammelte Scans.
| Scan # | ω Anfang | ω Bereich | Δω | φ | κ | 2θ | Nr. img | Zeit/Abbildung | Gesamtbelichtung |
| 1 | -136° | 186° | 0.15° | -180° | 0° | -37.8° | 1240 | 2s | 41m 20s |
| 2 | 55° | 37.95° | 0.15° | 84° | -171° | 36.9° | 253 | 2s | 8m 26s |
| 3 | 60° | 64.05° | 0.15° | -150° | 178° | 36.9° | 427 | 2s | 14m 14s |
| 4 | -27° | 27° | 0.15° | -97.7° | 112° | 36.9° | 180 | 2s | 6m |
| 5 | -119° | 118.05° | 0.15° | 30° | -57° | -37.8° | 787 | 2s | 26m 14s |
| 6 | -58° | 108° | 0.15° | -30° | -19° | -37.8° | 720 | 2s | 24m |
| 2h 14s | |||||||||
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Datenverarbeitung. Die Daten wurden auf 1,4 Å skaliert, wobei die Friedel-Paare als unterschiedliche Reflexe behandelt wurden, da die hohe Redundanz dies zuließ. Dies führte zu einem 100% vollständigen Datensatz mit einem Rmerge unter 10%. Um die 17 Schwefelstellen zu lokalisieren und die Daten zu phasen, wurde SHELXD³ für 500 Versuche ausgeführt. Die beste Lösung hatte einen CCAll = 25,1, CCWeak = 11,4, PATFOM = 0,93 und 14 Stellen mit hoher Belegung. Die 14 Stellen wurden für die Phasenverschiebung auf 1,5 Å mit SHELXE, die Verfeinerung der Stellen und die Phasenverbesserung mit MLPHARE⁴ und die Dichtemodifikation und Phasenerweiterung auf 1,4 Å mit DM⁵ verwendet. Die Verdienstziffer nach der Dichtemodifikation betrug 0,87. Anhand der anomalen Fourier-Differenz wurden 2 zusätzliche Schwefelstellen ermittelt und der Phasenbildungsprozess wiederholt. Die Phasen wurden an ARP/wARP⁶ für 2 Zyklen automatischer Modellerstellung übergeben, die ein Ausgangsmodell mit 205 aa ergab. Dieses Modell wurde manuell in Coot⁷ angepasst und für 10 Zyklen mit Refmac⁸ verfeinert, was zu einem R = 15,0% und einem Rfree = 16,2% führte. Abbildung 3 zeigt das Modell und die Karten in der Nähe von R53.
Tabelle 3: Kristallparameter und Verarbeitungsstatistiken für Thaumatin mit unmerged Friedel-Paaren.
| Raumgruppe | P4₁2₁2 |
| Einheitszelle (Å) | 57.8, 57.8, 149.8 |
| Auflösung (Å) (letzte Schale) | 20-1.4 (1.44-1.40) |
| Gesamtzahl der Reflexionen | 698447 |
| Eindeutige Anzahl von Reflexionen | 95481 |
| Vollständigkeit (%) (letzte Schale) | 99.9 (100) |
| Multiplizität (letzte Schale) | 7.3 (5.2) |
| <I/σ(I)> (letzte Schale) | 19.6 (1.7) |
| Rmerge (%) (letzte Schale) | 7.3 (88.8) |
| CC½ (letzte Schale) | 99.9 (57.7) |
| R / Rfree (%) | 15.0 / 16.2 |
Abbildung 3: 2Fo-Fc (graues Netz @ 2 rmsd), Fo-Fc (grünes und rotes Netz @ 3 bzw. -3 rmsd) und anomale Differenz (magentafarbenes Netz @ 5 rmsd) Elektronendichtekarten. R53 befindet sich in der Mitte und wird von zwei Disulfidbindungen flankiert.
Schlussfolgerung
Die Kristallstruktur von T. daniellii Thaumatin wurde durch S-SAD-Phasing auf 1,4 Å gelöst, wobei ein Datensatz verwendet wurde, der innerhalb von 2 Stunden auf dem XtaLAB Synergy-S System gesammelt wurde. Diese Lösung war in so kurzer Zeit möglich, weil das System einen hohen Flux und eine hohe Brillanz aufweist und das ultraschnelle Goniometer und der HyPix-6000HE-Detektor eine hohe Geschwindigkeit, Genauigkeit und Präzision bieten.
Referenzen
- Kabsch, W. (2010) Acta Cryst. D66, 125-132.
- Minor W., Cymborovski, M., Otwinowski, Z., & Chruszcz, M. (2006) Acta Cryst. D62, 859-866.
- Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst. D64, 112-122.
- Otwinowski, Z. (1991) Proceedings of the CCP4 Study Weekend.
- Cowtan K. (1994) Gemeinsamer CCP4 und ESF-EACBM Newsletter zur Proteinkristallographie 31, 34-38.
- Langer G., Cohen S.X., Lamzin V.S. & Perrakis A. (2008) Nature Protocols 3, 1171-1179.
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G. & Cowtan, K. (2010) Acta Cryst. D66, 486-501.
- Murshudov G.N., Vagin, A.A. & Dodson, E.J. (1997) Acta Cryst. D53, 240-255.
